Abstract:

Versione in italiano:

Le vescicole extracellulari (EVs) sono vescicole di dimensioni nanometriche a doppio strato lipidico (classificate in piccole EVs, cioè esosomi, e grandi EVs, cioè microvesicole) secrete dalla maggior parte dei tipi cellulari nello spazio extracellulare come effettori di segnalazione. Le EVs contengono un contenuto eterogeneo che include DNA, RNA (in particolare miRNA e mRNA), proteine, lipidi e metaboliti che, una volta consegnati alle cellule bersaglio, sono responsabili di una miriade di funzioni. I carichi delle EVs sono ampiamente considerati strumenti diagnostici; inoltre, le EVs costituiscono nanocarrier biologici caricabili con ulteriori molecole bioattive e sono considerate piattaforme di somministrazione di farmaci, soprattutto nel contesto della medicina di precisione, come dimostrato dall'impressionante numero di studi clinici. Tuttavia, l'uso delle EVs come agenti terapeutici di routine è attualmente limitato dalla conoscenza incompleta dei loro meccanismi di produzione e caricamento, e dalla difficoltà di selezionare le molecole del carico delle EVs durante la biogenesi.
Il presente progetto ha l'obiettivo di colmare queste lacune di conoscenza studiando il processo di biogenesi degli esosomi nella microglia umana, al fine di controllare il contenuto e le funzioni delle EVs, in particolare quelle relative al carico di RNA e alla sua consegna. A tal fine, saranno studiati la modulazione della biogenesi degli esosomi, il miglioramento della produzione di EVs e il monitoraggio del contenuto di RNA delle EVs mediante diversi stimoli biochimici, come composti modulanti classici della biogenesi, fame/rialimentazione di colesterolo e agenti pro- e anti-infiammatori, insieme ad analisi di RNA-seq. Inoltre, saranno sviluppati robusti sonde basate su fluorescenza, che consentono di monitorare i passaggi distinti dalla formazione dell'endosoma alla consegna del carico degli esosomi. In dettaglio, verranno effettuati saggi specifici utilizzando nuovi sensori GFP separati geneticamente codificati per i siti di contatto degli organelli MVB e la consegna di RNA mediata da EVs nelle cellule neuronali riceventi. Poiché diversi dati suggeriscono che il colesterolo possa giocare un ruolo cruciale nel regolare la biogenesi degli esosomi, particolare attenzione sarà dedicata alla distribuzione/tuning del colesterolo tra i diversi organelli, inclusi MVB e ILVs al loro interno.
Poiché i difetti nel metabolismo del colesterolo sono fortemente coinvolti nella neuroinfiammazione e nel morbo di Alzheimer, la produzione di EVs e il loro carico saranno contestualizzati nel quadro della neurodegenerazione dell'AD. Durante tutto il progetto, saranno messe in atto azioni specifiche per comunicare le attività del progetto alla comunità scientifica e a diversi pubblici target.

English version:

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid bilayer vesicles (classified in small EVs, i.e. exosomes, and large EVs, i.e. microvesicles) secreted by most cell types into the extracellular space as signalling effectors. EVs have a heterogeneous content including DNAs, RNAs (especially miRNAs and mRNAs), proteins, lipids, and metabolites that, once delivered into target cells, account for a plethora of functions. EVs cargoes are widely considered as diagnostic tools; in addition, EVs constitute biological nanocarriers loadable with further bioactive molecules, and are considered as drug delivery platforms, especially in the context of precision medicine, as evidenced by the impressive number of clinical trials. However, the EVs use as routine therapeutic agents is currently limited by the incomplete knowledge about their production and loading mechanisms, and the difficulty to select the EV cargo molecules during biogenesis.
The present project aims to bridge these gaps of knowledge by studying the exosome biogenesis process in human microglia, in order to control the EVs contents and functions, especially those related to RNA cargo and delivery. For these purposes, the modulation of exosome biogenesis, the improvement of EV production and the monitoring of the EV RNA content will be studied by means of different biochemical stimuli, such as classical biogenesis modulatory compounds, cholesterol starvation/refeeding and pro- and anti-inflammatory agents, together with RNA-seq analysis. Furthermore, robust fluorescence-based probes, allowing to monitor distinct steps from endosome formation to exosome cargo delivery will be developed. In detail, specific assays will be cariied-out using new genetically encoded split-GFP sensors for MVB-organelle contact sites and EV-mediated RNA delivery in receiving neuronal cells. Since several data suggest that cholesterol may play a crucial role in regulating exosome biogenesis, particular attention will be dedicated to cholesterol distribution/tuning among different organelles, including MVBs and ILVs therein.
As cholesterol metabolism defects are strongly involved in neuroinflammation and Alzheimer’s disease, EV production and cargo will be contextualized in the framework of AD neurodegeneration. Throughout the project, specific proposed actions to communicate the project activities to the scientific community and different target audiences will be put in place.

Contatti: tito.cali@unipd.it