Abstract:

Versione in italiano:

La sintasi dell'ATP mitocondriale è al centro della conservazione dell'energia nelle cellule dei mammiferi. È organizzata in subcomplessi catalitici F1 e intramembranosi FO, collegati da uno stelo centrale (CS) e uno stelo periferico (PS). Oltre alla produzione di ATP e alla formazione delle creste, la sintasi dell'ATP è coinvolta nella generazione del poro di transizione di permeabilità (PTP), un canale che media il rilascio rapido di Ca2+ (tempi di apertura brevi) e la morte cellulare (tempi di apertura lunghi). Investigaremo i meccanismi alla base della transizione della sintasi dell'ATP verso il PTP e definiremo ulteriormente i suoi ruoli nella fisiopatologia.

L'ipotesi sulla formazione del PTP è che la sostituzione di Mg2+ con Ca2+ nel sito catalitico F1 causi un cambiamento conformazionale trasmesso attraverso la proteina di conferimento di sensibilità all'oligomicina (OSCP) al PS, quindi alla "zona del fascio" di Fo che collega le subunità b, g ed e, e infine trasmesso al c-anello attraverso un'azione di trazione del C-terminale della subunità e, che si collega al c-anello tramite il tappo lipidico esterno che si affaccia nello spazio intermembranoso. L'apertura del PTP è favorita dal legame di CyPD con OSCP, che aumenterebbe la rigidità del PS. Affronteremo il problema come segue (Fig.1).

1. Abbiamo generato topi portatori di una mutazione condizionale T213S nella subunità beta della sintasi dell'ATP (Atp5bT213S), che riduce l'affinità per Ca2+ ma non per Mg2+, desensibilizzando il PTP agli effetti induttivi del Ca2+. L'espressione della mutazione T213S è indotta tramite incrocio con topi esprimenti CRE seguiti da trattamento con tamoxifene. Il PTP sarà caratterizzato in mitocondri isolati (inizialmente dal fegato) prima e dopo l'attivazione del trasgene per analizzare gli effetti fenotipici della mutazione. Parallelamente, verrà eseguita una caratterizzazione fenotipica completa dei topi Atp5bT213S. Verranno anche generate linee cellulari mutanti e caratterizzate per tassi di crescita, tempo di replicazione, incidenza di apoptosi, fenotipo mitocondriale, attività respiratoria, propensione all'apertura del PTP da parte del Ca2+, caratteristiche elettrofisiologiche del PTP.

2. Abbiamo generato cellule in cui la subunità e è stata sostituita con una versione troncata priva di 10 Aa al C-terminale, che consente l'assemblaggio di una sintasi dell'ATP funzionale in grado di formare dimeri; stiamo inoltre generando larve e adulti di Drosophila dopo knockdown delle subunità e e g per ottenere maggiori informazioni sulla funzione delle subunità di dimerizzazione in un animale vivente. Questi studi saranno abbinati a indagini di dinamica molecolare sugli eventi possibili alla base della formazione del canale.

3. Abbiamo scoperto che la coda N-terminale di CyPD è altamente mobile e la sua delezione aumenta notevolmente il legame di CyPD con OSCP in esperimenti in vitro. Definiremo come questo dominio, situato subito prima del dominio isomerasi, regola l'apertura del PTP modificando l'indirizzamento di CyPD e/o influenzando le sue modifiche post-traduzionali globali.

English version:

"Mitochondrial ATP synthase is at the core of energy conservation in mammalian cells. It is organized in catalytic F1 and intramembrane FO subcomplexes connected by a central stalk (CS) and a peripheral stalk (PS). Besides ATP production and cristae formation, ATP synthase is involved in generating the permeability transition pore (PTP), a channel mediating fast Ca2+ release (short open times) and cell death (long open times). We will investigate the mechanisms underlying the transition of ATP synthase to the PTP and further define its roles in pathophysiology.
The hypothesis about PTP formation is that replacement of Mg2+ with Ca2+ at the F1 catalytic site causes a conformational change transmitted through oligomycin-sensitivity conferral protein (OSCP) to the PS, then to the Fo “bundle region” connecting subunits b, g and e, and finally relayed to the c-ring through a pulling action of the C-terminus of subunit e, which connects with the c-ring thorough the outer lipid plug facing the intermembrane space. PTP opening is favored by binding of CyPD to OSCP, which would increase the rigidity of the PS. We will attack the problem as follows.
1. We have generated mice bearing a conditional T213S mutation in subunit beta of ATP synthase (Atp5bT213S), which decreases the affinity for Ca2+ but not Mg2+ desensitizing the PTP to the inducing effects of Ca2+. Expression of the T213S mutant is triggered by crossing with CRE-expressing mice followed by tamoxifen treatment. The PTP will be characterized in isolated mitochondria (initially from liver) before and after activation of the transgene to analyze the phenotypic effects of the mutation. In parallel, a full phenotypic characterization of the Atp5bT213S mice will be performed. Mutant cell lines will also be generated and characterized for growth rates, replication time, incidence of apoptosis, mitochondrial phenotype, respiratory activity, propensity to PTP opening by Ca2+, electrophysiological features of the PTP.
2. We have generated cells where subunit e has been replaced by a truncated version lacking 10 Aa at the C-terminus, which allows assembly of a functional ATP synthase able to form dimers; and we are generating Drosophila larvae and adults after knockdown of subunits e and g to gain more insights about the function of dimerization subunits in a living animal. These studies will be matched by molecular dynamics investigations of the possible events underlying channel formation.
3. We have found that the N-terminal tail of CyPD is highly mobile and its deletion markedly increases CyPD binding to OSCP in in vitro experiments. We will define how this domain, located just before the isomerase domain, regulates PTP opening by modification of CyPD addressing and/or by influencing its global post-translation modifications."

Contatti: marco.pirazzini@unipd.it